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干货来啦！AAV感染小鼠肠道及注射剂量指南

山东朱氏药业集团有限公司2022/10/12 13:02:13

近期，小编接触到很多老师咨询肠道方向的AAV的注射方式，本期我们将对肠道的病毒感染方式及AAV参考剂量进行总结。







首先，我们了解一下肠道系统的结构，小肠全长约4-6米，分为十二指肠、空肠和回肠三部分；上连胃幽门，下接盲肠随后连接大肠（包括盲肠含阑尾、升结肠、结肠右曲、横结肠、结肠左区、降结肠、乙状结肠、直肠）。

常见感染肠道的注射方式主要分为4种，分别为尾静脉注射、腹腔注射、灌肠和肠系膜动脉注射[1，2]。其中系统性的递送途径包括尾静脉注射和腹腔注射，这两种注射方式操作简单，但不具有特异性，除了肠道其他组织器官也有可能感染，同时病毒的损耗也会比较大：

一、 尾静脉注射尾静脉注射是常见的的系统性注射方式，通过这种方式可以感染全身的大多数器官，它的优点是操作简便，对动物的损伤较小，缺点是无法实现特异性感染，尤其是肝脏、血管等更易感。







具体步骤如下（来源于吉凯平台）：尾静脉注射示意图（图片来源于吉凯）










1. 实验前准备

准备内容：小鼠、小鼠固定器 ( 或 50ml 离心管）、1ml 注射器、酒精棉球、病毒 ( 冰浴融化）、生理盐水或 PBS。







2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴，将其放在鼠笼盖或手臂上，并进行适当安抚；

b. 然后将小鼠装入固定器 ( 可用 50ml 离心管改造）中，盖紧盖子，并使其尾巴朝外露出；

c. 用酒精棉球擦拭小鼠尾巴，使其血管扩张 ( 也可用热水、加热器等）。







3. 病毒注射

a. 用生理盐水或 PBS 将病毒稀释至合适滴度 ( 控制病毒注射体积在100-200μl）；

b. 用 1ml 注射器吸取 100~200μl 病毒；

c. 将小鼠尾巴拉直使其红色静脉清晰可见，在距尾尖 1/3 处进针，缓慢注入病毒后拔出，用棉球按压注射点 1min 左右以止血。







4. 动物恢复

将小鼠从固定器上取下，放回原饲养笼中。二、腹腔注射腹腔注射的方式适用于脂肪、肌肉、胰腺、肠道等全身器官，以及新生鼠（造成的损伤较小），通过这种递送途径，肠道的平滑肌及浆膜感染概率更大，可以观测到散在的GFP染色，但是上皮细胞感染的概率较小。







具体步骤如下（来源于吉凯平台）：腹腔注射示意图（图片来源于吉凯）










1. 实验前准备

准备内容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、1ml 注射器。

吸取病毒：用 1ml 注射器吸取适量病毒，置于冰上备用。







2. 小鼠固定

a. 首先提取小鼠尾巴，将其放在鼠笼盖或手臂上，并进行适当安抚；

b. 然后左手握小鼠，用拇指和食指捏住小鼠颈背部，用无名指及小指固定其尾和后肢，确保小鼠躯体舒展且不能乱动。







3. 病毒注射

a. 右手取吸好病毒的注射器，翻转左手使小鼠头部朝下且腹部完全暴露给操作者；

b. 手持注射器在下腹部离腹白线约 0.5cm 处下针，使针头与小鼠腹部约成 30°夹角刺入腹部，刺入过程中如感觉到抵抗力突然消失，表明针头已进入腹腔，此时调整针头方向约与小鼠腹部平行，缓缓进针；

c. 针头进入适当距离后，匀速注射病毒液后，缓缓拔出针头 ( 旋转针头以避免漏液）。







4. 动物复苏

将小鼠放回原饲养笼中，注意观察小鼠状态。







除了系统性的递送方式外也可通过局部注射的方式实现AAV的递送，肠道方向包括灌肠和肠系膜动脉注射的方式，优点是病毒剂量更小、可以直接感染需求部位，但同时也具备一定的缺点，那就是对动物造成的损伤更大。三、灌肠有文献报道通过灌肠的方式感染肠道组织，由于需要通过小鼠肛门插管进行灌肠，因此感染深度具有一定的局限性，感染结肠的概率更大，一般小鼠剂量推荐4E10vg/只以上，体积200μl。










具体步骤如下（来源于参考文献[1,3,4]）：







1. 实验前准备

准备内容：小鼠、病毒液 ( 冰浴融化）、聚乙烯导管。

吸取病毒：用 1ml 注射器吸取适量病毒，置于冰上备用。







2. 病毒注射

a．首先使用异氟醚麻醉小鼠；

b．然后将聚乙烯软管插入距离离肛门4厘米深的小鼠结肠部位，使用注射器缓慢注入适量的病毒；

c．注射完毕后，将小鼠在垂直倒立状态保持1分钟以上，以确保病毒在结肠部位的均匀分布；

d. 待小鼠复苏后可以恢复正常饮水及饮食。四、肠系膜动脉注射肠系膜动脉是分布于消化管的动脉，主要分为肠系膜上动脉和肠系膜下动脉，结合小肠结构图来看，肠系膜上动脉分布于小肠左侧，肠系膜下动脉分布于结肠、大肠及泄殖腔部位，因此通过该方法可以感染小肠及结肠部位的细胞。







具体方法如下（来源于参考文献[1,2,5]）：

a.  保定完成后使用异氟醚麻醉小鼠；

b.  通过左上方的皮肤进行1-2 cm的穿刺沿着腋线和侧腹的脾脏区域。切开腹外斜肌暴露SMA（肠系膜动脉）。使用微型牵开器将皮肤和腹壁固定，并用温暖的盐水纱布覆盖小肠防止回缩；

c.  使用微血管放大器在放大20倍的情况下，将SMA轻轻地从腹膜后剥离，在近端伤口周围放置连接注射针，使用一个微型血管钳暂时夹闭血管腹主动脉；

d. 将定制33号1/2‘’英寸点式2型进样针（Hamilton; Reno, NV)）连接250 μl汉密尔顿TLL气密性进样针注射器插入肠系膜动脉，轻轻结扎血管保持稳定防止注射泄漏，随后进行病毒注射；

e.  注射结束后取下注射器械，解除夹闭，使血液流回肠道组织。




肠系膜动脉注射示意图




*后，小编对肠道系统的AAV注射方法及剂量进行总结，大家可以根据自己需求进行选择预实验的参考剂量，设置梯度，选择*佳剂量：







肠道系统AAV感染范围及剂量参考注射方法感染部位参考剂量注射体积尾静脉注射全身大部分器官、血液系统＞2E11vg/只

小鼠100-200μl灌肠结肠更易感（少量肠上皮细胞感染）4E10vg-1E11vg/只小鼠200μl

大鼠700 μl腹腔注射腹腔肠道平滑肌、浆膜感染

（无上皮细胞感染）＞1E11vg/只50-100μl（不超过10 μl/g）肠系膜动脉注射肠系膜上动脉小肠左侧（可感染上皮细胞）5E10vg-1E11vg/只100-200μl肠系膜下动脉结肠（更易感）、大肠、泄殖腔（可感染上皮细胞）




【参考文献】

[1] Polyak S , Mah C , Porvasnik S , et al. Gene delivery to intestinal epithelial cells in vitro and in vivo with recombinant adeno-associated virus types 1, 2 and 5.[J]. Digestive Diseases and Sciences, 2008, 53(5):1261-1270.

[2] Steven P , Annette M , Stacy P , et al. Identification of adeno-associated viral vectors suitable for intestinal gene delivery and modulation of experimental colitis[J]. American Journal of Physiology Gastrointestinal & Liver Physiology, 2012, 302(3):296-308.

[3] Zheng X , Lv Y , Li S , et al. Adeno‐associated virus‐mediated colonic secretory expression of HMGB1 A box attenuates experimental colitis in mice[J]. Journal of Gene Medicine, 2016.

[4] Zheng X Y , Lv Y F , Li S , et al. Recombinant adeno-associated virus carrying thymosin β4 suppresses experimental colitis in mice[J]. World Journal of Gastroenterology, 2017, 23(2):242.

[5] Porvasnik S L , Mah C , Polyak S . Targeting murine small bowel and colon through selective superior mesenteric artery injection[J]. Microsurgery, 2010, 30(6):487-493.